第四节 临床应用

　　(一)寻找病因 寻找病因是认识疾病的重要基础，传统的依靠临床症状、体征、病程进展、生化检查、病理学形态观察等手段推断疾病病因的模式至今仍在发挥、并且将来也将继续发挥重要作用，但有些疾病在上述现象出现以前很长一段时间就已经开始发生和发展，如果能在疾病发生早期明确找到病因，无疑可将疾病防治控制在萌芽状态。例如，应用PCR技术动态监测幽门螺杆菌(helicobacter pylori, HP)，理论上HP在正常胃内群集繁殖、持续感染可逐步引起胃上皮细胞的变性、坏死及萎缩，继而出现肠上皮化生。有研究发现在正常胃粘膜～胃炎～肠上皮化生～非典型增生～胃癌转化过程中，HP检出率在肠上皮化生和早期非典型增生阶段最高，而后逐渐下降，提示HP可能系胃癌发生的始动因素，而遗传、饮食、营养等综合因素决定了胃癌的最后形成。

　　(二)探讨发病机制 明确疾病的发生机制是准确诊断和合理治疗疾病的理论基础，分子生物学理论和技术的发展使得人们从分子水平早期深人探讨疾病的发生机制成为可能。例如，形态学上结肠、直肠癌的发生发展过程具有明显的阶段性，即正常肠上皮～非典型增生～早期腺瘤～中期腺瘤～晚期腺瘤～癌变。深人的分子生物学研究发现，APC基因突变被认为是引起肠上皮非典型增生的原因，DNA去甲基化诱发早期腺瘤形成，K-ras基因突变使早期腺瘤向中期腺瘤转化, DCC基因缺失使中期腺瘤向晚期腺瘤发展，p53基因缺失和突变导致晚期腺瘤癌变。

　　(三)诊断

　　1.单基因遗传病的基因诊断 由于单基因病的遗传基础是基因组DNA中决定某一性状的基因位点存在基因变异，因此确定这一基因致病性变异是否存在，是诊断单基因病的关键。利用分子生物学技术，目前已有相当部分的单基因病可以进行基因诊断，这些疾病的共同特点是疾病的性质及致病基因的染色体定位已经明确，基因的DNA序列已全部或部分弄清，因此可用基因特异性探针或特异性引物进行检测，常用的检测方法有：限制性片段长度多态性(RFLP )分析法、斑点杂交法、PCR产物直接测序分析法。

　　2.多基因遗传病的基因诊断 尽管多基因病的遗传基因较为复杂，但在不少多基因病中往往只有一个或少数几个遗传基因起主导作用，这就为多基因病的分子生物学研究提供了重要途径，使人们有可能应用分子生物学技术从部分基因位点着手寻找多基因病的致病基因。一种途径是寻找疾病大家系，应用随机RFLP连锁标记，开展广泛的家族研究，就有可能发现与疾病易感性有关基因的连锁关系，这时，通过逆向遗传学方法可以鉴别该基因。通过这种途径，已经鉴别出一些乳腺癌、结肠癌和胰腺癌遗传易感性有关的基因。另一种途径是通过假定某一基因特定功能异常可能引起疾病，推断哪些基因可能与该疾病有关，一旦分离了这些所谓的候选基因并获得了适当的RFLP标记，就可开展家族研究，了解某些基因多态性是否与特定疾病的遗传分离。

　　3.遗传易感性疾病的基因分析 有遗传倾向的疾病又称遗传易感性疾病。从发病倾向和人群中发病分布分析，可以发现这一类疾病往往具有明显的家族性。但是家系分析表明，这类疾病又不是简单地按照孟德尔遗传规律遗传，大多数引起这类疾病的责任基因也未确定，对于这一类疾病，通常都采用连锁分析法进行基因分析。如近两年来对遗传倾向明确的家族性乳腺癌的研究，已定位克隆了两个相关基因BRCAl(位于17q21) 和BRCA2(位于13q12)，尽管它们的结构完全不同，但在生物学功能、肿瘤发生机制以及流行病学特征等方面有很多相似之处。BRCA突变可影响其转录调控及损伤修复功能，而后者则是获得肿瘤易感性的主要原因。家族性乳腺癌病人中，约45%发生BRCAl突变，35%有BRCA2突变。散发性乳腺癌病人中尚未观察到BR-CA突变。因此，检测BRCA突变可作为家族性乳腺癌遗传易感性的重要参考指标。

　　4.病原体的基因诊断 感染性疾病是由某种病原体侵入人体所致，这些病原体包括病毒、细菌、衣原体、立克次体、支原体、螺旋体、原虫、真菌等。过去，对这些病原体的分离、鉴定，是一项费时、耗财的工作，在某些感染的早期或疾病的后期，分离、鉴定病原体难度更大、甚至不可能。随着分子生物学技术的发展，直接检测这些病原体的特异性基因成为可能。应用PCR技术检测这些病原体，具有方法简便、结果可靠、快速、对检材要求低、适应性广泛和节省等许多优点，因而已在感染性疾病诊断中广泛应用。基因诊断在感染性疾病中的应用主要包括以下几方面：快速准确地诊断出致病病原体；用于检测带菌者和潜在性感染；大规模的病原流行病学现场筛查工作；对医学微生物科、属、种的准确分类鉴定；培养基和无菌试剂微生物的检测；病原体抗药性的快速敏感试验测定等。

　　5.肿瘤分子诊断 常用方法有：肿瘤易感基因检测；基因过表达检测；基因突变检测；限制性片段长度多态性分析；微卫星不稳定性分析；端粒酶活性检测；放射免疫显像检测；肿瘤标志物检测。

　　(四)治疗

　　1.肿瘤基因治疗 1990年9月14日，美国国立卫生研究院(NIH)首次对一位腺苷酸脱氨

　　酶(ADA)缺乏症病人进行了临床基因治疗并获得了成功，因此受到全世界科学家的广泛重视，并掀起了基因治疗研究的热潮。本章第三节已详细阐述了基因治疗的基本概念、基本条件和基本步骤，现以原发性肝癌为例，介绍肿瘤基因治疗的策略：①输入细胞因子基因：该基因能增强机体免疫功能，使宿主产生有效的抗肿瘤免疫反应，主要有干扰素类、白细胞介素类、克隆刺激因子类、肿瘤坏死因子及转化生长因子等细胞因子基因。②输入主要组织相容性复合物(MHC)抗原基因：将MHC-Ⅰ类抗原(如HLA-B7, HLA-B27)基因原位导入缺乏MHC-Ⅰ类抗原表达的肿瘤细胞中，诱导产生肿瘤特异性细胞毒作用以杀灭肿瘤。③抑癌基因的导入治疗：用替代或添加的方法将某种抑癌基因导入肿瘤细胞中，使其发挥抗癌作用，如将野生型p53基因导入肝癌细胞中，可引起癌细胞凋亡。④抑制癌基因的表达：采用反义核苷酸序列在癌基因表达时与mRNA特异性结合，以期阻断癌基因的表达，如应用N-ras反义核酸治疗肝癌。⑤导入“自杀”基因：将某些病毒、细菌中特有的前药转换酶基因—自杀基因导入肝癌细胞，自杀基因编码的特异性酶类将无毒的药物前体在肝癌细胞内代谢成毒性产物，从而达到杀死肝癌细胞的目的。

　　2.器官移植 尽管器官移植已经取得了很大进展，但是供体器官不足和免疫排斥，仍然是当前该领域的一大障碍。异种移植被提议作为解决器官不足问题的方法，但遗憾的是异种移植仅有短期存活的报道，尚无长期幸存的记录。利用来自人类基因组计划的信息资料，外科医生可以通过基因工程技术从遗传学的角度改造动物，从而使被改造的动物携带不同组合的人类特异性抗原。可以预期，不久的将来，人们可以生产出其免疫系统非常类似于人的动物，使异种移植更具有可行性，并减少对同种器官供体的依赖性。

　　解决器官移植供体器官不足的另一种可能方法是器官克隆。由于新近克隆绵羊和牛已获成功，所以器官克隆技术受到普遍关注。尽管目前人们对整体动物的克隆非常投入，但对器官移植而言，最有希望的研究领域应用是

　　(五)预防 在疾病出现临床症状、体征或生化改变之前，应用分子生物学方法普查，以筛选有关疾病的高危人群，并给予化学预防或预防性治疗，以期预防疾病的发生、发展。随着癌高危人群逐渐得以鉴定，化学预防是介于Ⅰ级病因预防与癌前或早癌之间，针对发生的早期阶段分子变化而干预，如大肠息肉病者有主张给予非街体类抗炎药物如舒林酸钠、阿司匹林及抗环氧化酶-2药物等。预防性外科手术不久将可能成为更流行的抗癌治疗的第一线方法。例如，有关ret原癌基因的突变与遗传性甲状腺髓样癌相关性的研究，使外科医生发现ret原癌基因突变者最终将发生甲状腺髓样癌，因此，有学者主张对Ⅱ型多发性内分泌瘤病的病人，应检测ret原癌基因，如发现该基因突变者，即可行预防性甲状腺切除术。又如，鉴于BRCA1或BRCA2突变对家族性乳腺癌的早期诊断价值，故有学者提出对BRCAl或BRCA2突变者施行双侧乳腺切除术，尤其对30-40岁的高危妇女更为适宜。再如，对于遗传性非息肉病性结肠癌病人，如果查出hMSH2，hMLH1突变，有主张宜施行次全结肠切除、回直肠吻合术，以免日后易位瘤的高危发生；但对于遗传性非息肉病性结直肠癌病人的无症状家族成员，即使查出DNA错配修复基因突变，也不主张施行预防性手术，而应定期给予结肠镜检查，动态监视结直肠癌的可能发生，并及时手术。

　　总之，从分子生物学角度探讨外科疾病的病因、发病机制、诊断、治疗和预防，是赋于外科医生一个划时代的历史使命；同时，来源于外科实践的研究成果也将反馈于包括分子生物学在内的整个生命科学，从而推动生命科学的进步。因此，外科学的发展与分子生物学息息相关。随着分子生物学基础研究日益向纵深发展，相信不久的将来一个令人振奋的分子外科学新时代将展现在我们面前，并将极大地造福于人类。