| DNA的合成(复制) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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| http://www.sina.com.cn 2004/10/09 14:33 双博士丛书 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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DNA的合成(复制) 考点： DNA复制、DNA损伤与修复、逆转录过程有关的基本概念。包括：半保留复制，半不连续复制，复制叉，复制子，岡崎片段，领头链，随从链，端粒，端粒酶等； 复制的过程，以及复制过程中涉及到的各种酶、蛋白因子； 并掌握原核生物与真核生物复制的相同点与不同点。逆转录过程，熟悉逆转录酶的应用；DNA突变的概念及突变类型、修复机制。 重点： DNA分子在生物体内的合成三种方式：DNA复制；修复合成；反转录合成。 难点： DNA复制的基本过程，以及所参与酶和因子。真核生物与原核生物的比较，真核生物DNA复制有多个起始点、5种DNA聚合酶以及有端粒复制等特点。 DNA复制 一、DNA的复制的特征 1．半保留复制 在DNA复制时，亲代的每一条链均可作为模板合成一条新链。一条来自亲代的旧链与一条新链以氢键相连，形成子代双链DNA。由于两个子代分子中各有一条链来自亲代，而另一条链是新生成的，所以这就是半保留复制方式。 2复制的起始点与方向 DNA分子复制时，在亲代分子的一个特定区域内双链打开，随之以双链为模板复制生成两个子代DNA双链分子。开始时，复制起始点呈现一叉形(或Y形)，称为复制叉，随复制进行，复制叉向前移动。 （1）复制的起始点。 DNA复制要从DNA分子的特定部位开始，此特定部位称为复制起始点。在原核生物中复制起始点常位于染色体的一个特定部位，即只有一个起始点。 真核生物的染色体在几个特定部位进行DNA复制，有多个复制起点。 （2）复制的方向。 复制的方向可以有三种不同的机制。其一是从两个起始点开始，各以相反的单一方向生长出一条新链，形成两个复制叉。例如腺病毒DNA的复制，其二是从一个起始点开始，以同一方向生长出两条链，形成一个复制叉。其三是从两个起始点开始，沿两个相反的方向各生长出两条链，形成两个复制叉，这种方式最为常见，称为双向复制。 3．半不连续合成 DNA的双螺旋结构中的两条链是反向平行的，当复制开始解链时，亲代DNA分子中一条母链的方向为5′～3′，另一条母链的方向为3′～5′。DNA聚合酶只能催化5′～3′合成方向。在以3′～5′方向的母链为模板时，复制合成出一条5′～3′方向的前导链，前导链的前进方向与复制叉的行进方向一致，前导链的合成是连续进行的。而另一条母链仍以3′～5′方向作为模板，复制合成一条5′～3′方向的随从链，因此随从链会成方向是与复制叉的行进方向相反的。随从链的合成是不连续进行的，先合成许多片段，即冈崎片段。最后各段再连接成为一条长链。由于前导链的合成连续进行的，而随从链的合成是不连续进行的，所以从总体上看DNA的复制是半不连续复制。 （ 二）复制的过程和参与酶及因子 复制的过程分四个阶段。第一阶段，亲代DNA分子超螺旋的构象变化及双螺旋的解链，将复制的模板展现出来。第二阶段为复制的引发阶段，有引物RNA进行5′～3′方向的合成。第三阶段为DNA链的延长，在引物RNA合成基础上，进行DNA链的5′～3′方向合成，前导链连续地合成出一条长链，随从链合成出冈崎片段。去除RNA引物后，片段间形成了空隙，DNA聚合酶作用使各个片段靠近。在连接酶作用下，各片段连接成为一条长链。第四阶段为终止阶段，复制叉行进到一定部位就停止前进，最后前导链与随从链分别与各自的模板形成两个子代DNA分子，到此复制过程就完成了。 1螺旋的松弛与解链 包括超螺旋的构象变化及双螺旋的解链，参与者主要为拓扑异构酶、解链酶及单链结合蛋白等。 （ 1）拓扑异构酶。 拓扑异构酶可改变DNA拓扑性质。在DNA复制时，复制叉行进的前方DNA分子总是产生超螺旋，拓扑酶可松弛超螺旋，还可以引入负超螺旋，有利于复制叉的行进及DNA的合成。在复制完成后，拓扑酶又可将DNA分子引入超螺旋，有利于DNA缠绕、折叠、压缩以形成染色质。 DNA拓扑酶有多种，主要有Ⅰ型及Ⅱ型。 拓扑异构酶Ⅰ（Topo Ⅰ），将环状双链DNA的一条链切开一个口，切口处链的末端绕螺旋轴按照松弛超螺旋的方向转动，然后再将切口封起。拓扑酶I松弛超螺旋不需ATP参与。 拓扑异构酶Ⅱ（Topo Ⅱ），它的作用特点是切开环状双链DNA的两条链，分子中的断端经切口穿过而旋转，然后封闭切口。Topo Ⅱ在ATP参与下，将DNA分子从松弛状态转变为负超螺旋，为DNA分子解链后进行复制及转录作好准备。 （2）解链酶。 DNA复制进行时，首先要在复制起点处解开双链，反应是在一类解链酶的催化下进行的。解链酶要通过ATP的分解获得能量，以解开双链。 大部分的解链酶在复制叉的进行中连续地解开DNA双链，它们与随从链的模板相结合，沿着模板的5′→3′方向沿复制叉的进行而移动，例如解链酶Ⅱ、Ⅲ等。只有rep蛋白，(一种解链酶)是结合在前导链的模板上，沿模板的3′→5′方向移动，所以在DNA复制时，一些解链酶与rep蛋白可能是分别在两条DNA母链上协同发挥作用，以解开双链。 （ 3）单链结合蛋白(SSB)。 单链结合蛋白与解开的DNA单链相结合，可稳定此单链以利于其发挥模板作用。SSB也与复制新生的DNA单链相结合，以保护其免于被核酸酶水解。 2引发 DNA复制开始时，先要有引发阶段，即有引物RNA的合成。前导链的引发较简单，在引发酶催化下，有一个短的RNA引物合成，继而从RNA引物的3′末端开始连续进行DNA链的合成。随从链的合成是不连续的，引发阶段也比较复杂，有多种蛋白及酶参与，主要的是引发酶及引发前体。 （1）引发酶。一种特殊的 RNA聚合酶，可催化RNA短片段的合成。RNA合成反应是以DNA为模板按碱基互补规律，加入核苷酸从5′→3′方向合成RNA片段，称为RNA引物。RNA引物的3′末端为游离的羟基。 （2）引发前体。引发前体包含有多种蛋白质因子。引发前体沿随从链的模板DNA顺复制叉的行进方向移动，它连续地与引发酶联合并解离，从而在不同部位引导引发酶催化合成RNA引物。这也为随从链的不连续合成准备了条件。 引发过程中合成了随从链的RNA引物，在引物3′-OH末端进行DNA片段的合成。 3DNA链的延长 DNA链的延长是在DNA聚合酶催化下，以四种三磷酸脱氧核苷为原料，进行的聚合作用。反应体系中有DNA模板、引物及Mg2+的存在。聚合作用是自引物的3′-OH端上开始，以5′→3′方向逐个加入脱氧核苷酸，使DNA链得以延长。 在原核生物及真核生物，DNA聚合酶有几种类型。 （1）大肠杆菌DNA聚合酶 1)DNA聚合酶Ⅰ。在随从链合成时，先合成了许多冈崎片段，而后由于RNA引物的去除形成了空隙，此时DNA PolⅠ它催化聚合反应，延长了各个片段，从而填补了片段间的间隙，使以上片段得以靠近，为片段连接成长链创造了条件。所以DNA polⅠ的聚合作用主要是在填补随从链片段间空隙上发挥作用。 DNA PolⅠ还具有3′→5′外切酶活性可识别并去除错误的碱基，然后再继续进行聚合作用。这种活性在DNA复制中起了编辑作用，校对功能。DNA PolⅠ的校对活性对DNA复制的准确性起着重要作用。 DNA PolⅠ还具有5′→3′外切酶活性。5′→3′外切酶活性也有修正错误的功能，补充其3′→5′外切酶修正错误的作用。例如紫外照射产生的嘧啶二聚体，就是在其5′→3′切酶作用下切除的。 2)DNA聚合酶Ⅱ。DNAPolⅡ具有催化5′→3′方向的DNA合成反应的活性。它也有3′→5′外切酶活性，而无5′→3′外切酶活性。它在体内的功能还不清楚，可能在损伤修复中有特殊作用。 3)DNA聚合酶Ⅲ。 DNA PolⅢ是一个由多种亚基组成，这些亚基组成两个亚单位而形成不对称的二聚体。DNAPolⅢ在DNA复制中链的延长上起主要的作用。 DNA PolⅢ结构中不对称的二聚体，同时分别催化着前导链和随从链的合成。 DNA PolⅢ也具有3′→5′外切酶活性，所以对于DNA复制也有校对的功能，可停止加入或除去错误的核苷酸然后继续加正确的核苷酸。因此，DNA PolⅢ配合DNAPolI可将复制的错误率大大地降低，从10-4降为10-6或更少。 当此片段接近前方的片段时，由DNA PolⅢ的5′→3′外切酶活性切除了RNA引物，造成了片段间的空间；继而DNA PolI催化进行5′→3′方向的聚合作用，填补了片段间的空隙。 下面小结：大肠杆菌中DNA聚合酶，见表。
酶活性5′→3′聚合作用3′→5′外切酶活性5′→3′外切酶活性 +++ ++- +++ 构成(亚基数) 单体 不详 多亚基 体外链延长速度(核苷酸/分) 600 30 9000 分子数/细胞 400 不详 10～20 功能 修复合成去除引物填补空隙校对 不详 复制校对 （2）真核生物DNA聚合酶。 真核生物DNA Pol有α、β、γ、δ及五种。 真核生物的DNA复制是在DNA聚合酶α与DNA聚合酶δ互配合下催化进行的，还有一些酶及蛋白质因子参与反应。DNA Polα与引发酶共同起引发作用，然后由DNA Polδ催化前导链及随从链的合成。在链的延长中，有 PCNA（增殖细胞核抗原）参与，保障连续性DNA Pol的性质与DNA Polδ有相似之处，在有些情况下，它可代替 DNA Polδ起作用，例如在DNA损伤时，催化修复合成。DNA Polγ是线粒体中DNA复制酶。 DNA Polδ及均有外切酶活性，因此也有编辑功能，校正复制中的错误。它们的5′→3′外切酶活性可能在切除引物RNA中有作用。 下面：小结真核生物DNA聚合酶，见表。
酶活性5′→3′聚合作用3′→5′外切作用 α β γ δ e +- +- ++ ++ ++ 细胞内定位功能 核复制、引发 核修复 线粒体复制 核复制 核复制 （3）连接酶 DNA复制过程中，经过了链延长阶段后，合成出的前导链为一条连续的长链。随从链则是由合成出许多相邻的片段，在连接酶的催化下，连接成为一条长链。连接作用是在连接酶催化下进行的。连接酶的作用是催化各相邻的DNA片段以3′→5′磷酸二酯键相连接。连接反应中的能量来自ATP（或NAD+）。 4终止 终止区，在此区中包括有5个ter序列，其核心序列为GTGTGTGT，它们可以和Tus蛋白结合，阻止了解链酶发挥作用，促使复制的终止。 DNA复制完毕后，又可在拓扑酶作用下，在DNA分子中引入超螺旋结构，进行进一步的装配。 下面小结：参与大肠杆菌DNA复制的蛋白，见表。
蛋白质 作用 DnaB蛋白(拓扑异构酶Ⅰ) 开始解链 引物酶(DnaG) 合成RNA引物 rep蛋白(解链酶) 解开双链 SSB(单链结合蛋白) 稳定单股链区 DNA旋转酶(拓扑异构酶Ⅱ) 引入负超螺旋 DNA polⅢ全酶 合成DNA DNA polⅠ 去除引物，补充空隙 DNA连接酶 连接DNA片段 DnaA蛋白 连接DNA片段辨认起始点 （三）真核生物DNA的复制特点 （1）真核生物中复制进行的速度约为50个核苷酸／秒，仅为原核生物的1／10，但真核生物染色体上DNA复制起始点有多个，因此可以从几个起始点上同时进行复制。 （2）真核生物DNA复制过程中的引物及冈崎片段的长度均小于原核生物。真核长约100-200个核苷酸，原核长约1000-2000个。 （3）其真生物DNA的复制有DNA聚合酶及多种蛋白质因子参与，DNA聚合酶也有多种类型。其中DNA Polα及DNA Polδ在细胞核内DNA的复制中起主要作用。DNAPolδ催化前导链及随从链的合成，PCNA参与其作用。 DNA Polα与引物酶共同催化引发链的合成。DNA Polδ有3′→5′外切酶活性，因此有校正的功能。 DNA Pol γ是线粒体中的复制酶。 二、反转录作用及端粒酶 1.反转录作用 反转录作用即是以RNA为模板，由dNTP聚合生成DNA的作用。催化此反应酶为反转录酶或逆转录酶。 反转录酶具有多种酶活性，其催化的反应是：①RNA指导的DNA合成反应；②RNA的水解反应；③DNA指导的DNA合成反应。 反转录酶催化的DNA合成反应也是5′→3′合成方向。在DNA合成开始进行时，需要有引物。 反转录酶没有3′→5′外切酶活性，因此它没有校正功能，反转录作用的错误率相对较高。 2端粒酶 真核生物线形染色体的末端具有一种特殊的结构，称为端区或端粒。端区结构中有核苷酸重复序列，一般在一条链上为TxGy，互补链为CyAx，x与y大约在1-4范围内，人的端粒区含有TTAGGG重复序列。 端区具有保护DNA双链末端，使其免遭降解及彼此融合的功能。端区的平均长度随着细胞分裂次数的增多及年龄的增长而变短，可导致核生物染色体稳定性下降，并导致衰老。其分子机制在于，线形DNA分子不能从末端核苷酸外合成RNA引物，如此染色体将逐代缩短。但是在生殖细胞、胚胎细胞和肿瘤细胞中，由于有端粒酶，所以并不出现这种情况。 端粒酶是一种由RNA和蛋白质组成的酶，RNA和蛋白质都是酶活性必不可少的组分。可看作是一种反转录酶。此酶组成中的RNA可作为模板，催化合成端区的DNA片段。端粒酶催化合成端区，在保证染色体复制的完整性上有重要意义。 三、DNA的修复合式 需要进行修复的DNA损伤，见表：
DNA损伤 原因 碱基丢失 酸及热去嘌呤 碱基变化 电离辐射，烷化剂 错误的碱基 自发脱氨基作用：C→U，A→次黄嘌呤 缺失/插入 嵌入剂 环丁基二聚体 紫外辐射 DNA链断裂 电离、化学物质诱导(博莱霉素) DNA链交联 化学物质诱导(丝裂霉素) （一）DNA复制过程中的校正修复 DNA复制过程中会发生错误的，这可以由DNA聚合酶来修正错误。在大肠杆菌DNA复制过程中，如果有错误核苷酸掺入，DNA聚合暂时停止催化聚合作用，而是由DNA PolⅠ或 PolⅢ的 3′→5′外切酶活性切除错误的碱基，然后继续再催化正确的聚合作用。真核生物DNA Polδ也具有此种校对作用。所以DNA聚合酶的校对作用是DNA复制中的修复形式，可使错配率下降至10-6。 其他能够保证DNA复制准确性的机制在于： （1）以亲代DNA为模板，按碱基互补配对方式进行DNA复制。 （2）细胞内DNA错配修复机制，可使错配减少至10-9以下。 （二）DNA的损伤修复 修复是指针对已发生了的缺陷而施行的补救机制，DNA的修复机制的有数种方式，有光修复、切除修复、重组修复、SOS修复等，其中以切除修复最为重要。 1光修复 通过光修复酶催化而完成的，仅需300-600nm波长照射即可活化，普遍存在于各种生物，人体细胞中也有发现。通过此酶作用，可使环丁基二聚体分解为原来的非聚合状态，DNA完全恢复正常。 2切除修复 切除修复是指对DNA损伤部位先行切除，继而进行正确的合成，补充被切除的片段。大肠杆菌有两种切除修复方式。 （1）由糖基化酶起始作用的切除修复。 糖基化酶识别损伤或错误的碱基而水解糖苷键，造成DNA骨架中因丢失碱基而形成一个洞，称为AP部位。特异的AP内切酶识别AP位点，切断其与DNA骨架的连接；继而在外切酶作用下，切下AP位点的核苷酸。随后，在DNA聚合酶Ⅰ的作用下，以未受损伤的DNA链为模板正确合成，补充缺口，最后在连接酶作用下连成一条完整的DNA链。 （2）UvrABC修复。原核生物与紫外线损伤修复有关的一些基因，称为UvrA、UvrB、UvrC。其产物，UvrA，UvrB是辨认及结合DNA损伤部位的蛋白质，UvrC有切除损伤部位相邻12个核苷的酸的作用，可能还需要有解螺旋酶的协助，才能把损伤部位除去。然后由DNA聚合酶Ⅰ补充空隙，连接酶连接，完成修复。 3重组修复 当DNA分子的损伤面较大，还来不及修复完善就进行复制时，损伤部位因无模板指引，复制出来的新子链会出现缺口，这时，就靠重组蛋白recA的核酸酶活性将别一股健康的母链与缺口部分进行交换，以填补缺口。 4SOS修复 指DNA损伤时，应急而诱导产生的修复作用，称为SOS修复。在正常情况下，修复蛋白的合成是处于低水平状态的，这是由于它们的mRNA合成受到阻遏蛋白LexA的抑制。细胞中的recA蛋白也参与了SOS修复。当DNA受到严重损伤时，recA以其蛋白酶的功能水解破坏LexA，从而诱导了十几种SOS基因的活化，促进了此十几种修复蛋白的合成。 |
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