| 基因诊断与基因治疗 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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| http://www.sina.com.cn 2004/10/09 15:29 双博士丛书 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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基因诊断与基因治疗 考点： 基因诊断的定义及常用技术方法； 基因治疗的定义、采用方法和基本程序。 重点： 基因诊断的概念和特点。基因诊断的常用技术方法：常用方法有①核酸分子杂交技术，包括限制性内切酶酶谱分析法、DNA限制性片段长度多态性（RFLP）分析、等位基因特异寡核苷酸探针（ASO）杂交法。②PCR。③基因测序。 基因治疗的概念和常用方法：常用方法有基因矫正、基因置换、基因增补、基因失活、引入自杀基因。 难点： 基因诊断的方法及其原理，基因治疗载体的选择。 一、基因诊断 （一）基因诊断的概念和特点 所谓基因诊断就是利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。 基因诊断的特点：①以基因作为检查材料和探查目标，属于“病因诊断”，针对性强。②分子杂交技术选用特定基因序列作为探针，具有很高的特异性。③分子杂交和聚合酶链反应都具有放大效应，诊断灵敏度很高。④适用性强，诊断范围广，检测目标可为内源基因也可为外源基因。 （二）基因诊断的常用技术方法 1核酸分子杂交技术 以检测样本中是否存在与探针序列互补的同源核酸序列。常用有以下方法。 （1）限制性内切酶分析法。 此方法是利用限制性内切酶和特异性DNA探针来检测是否存在基因变异。当待测DNA序列中发生突变时会导致某些限制性内切酶位点的改变，其特异的限制性酶切片段的状态在电泳迁移率上也会随之改变，借此可作出分析诊断。 （2）DNA限制性片断长度多态性分析。 在人类基因组中，平均约200对碱基可发生一对变异（称为中性突变），中性突变导致个体间核苷酸序列的差异，称为DNA多态性。不少DNA多态性发生在限制性内切酶识别位点上，酶解该DNA片段就会产生长度不同的片断，称为限制性片段长度多态性(RFLP)。RFLR按孟德尔方式遗传，在某一特定家族中，如果某一致病基因与特异的多态性片断紧密连锁，就可用这一多态性片段为一种“遗传标志”，来判断家庭成员或胎儿是否为致病基因的携带者。甲型血友病、囊性纤维病变和苯丙酮尿症等均可借助这一方法得到诊断。 （3）等位基因特异寡核苷酸探针杂交法。遗传疾病的遗传基础是基因序列中发生一种或多种突变。根据已知基因突变位点的核苷酸序列，人工合成两种寡核苷酸探针：一是相应于突变基因碱基序列的寡核苷酸；二是相应于正常基因碱基序的寡核苷酸，用它们分别与受检者DNA进行分子杂交。从而检测受检者基因是否发生突变，以及是否有新的突变类型。 2.聚合酶链反应(PCR) PCR技术采用特异的引物，能特异地扩增出目的DNA片段。由于在基因顺序中突变区两侧的碱基序列和正常基因仍然相同。因此。根据待测基因两端的DNA顺序设计出一对引物，经PCR反应将目的基因片断扩增出来，即可进一步分析判断致病基因的存在与否，并了解其变异的形式。 相同长度的单链DNA基因碱基序列不同，甚至单个碱基不同，都可能形成不同的空间构象，从而在电泳时泳动速率不同。PCR产物变性后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，正常基因和变异基因的迁移位置不同，借此可分析确定致病基因的存在，这就是PCR/单链构象多态性分析。其他方法还有PCR/ASO法、PCR/RFLP法、PCR/限制性酶谱法。 3基因测序 分离出患者的有关基因，测定出碱基排列顺序，找出其变异所在，这是最为确切的基因诊断方法。 （三）基因诊断的应用 随着基因诊断方法学的不断改进更新，它已被广泛地应用于遗传病的诊断中。如对有遗传病危险的胎儿在妊娠和产前诊断的，杜绝患儿出生。 基因诊断除用于细胞癌变机制的研究外，还可对肿瘤进行诊断、分类分型和愈后检测。 在感染性疾病的基因诊断中，不仅可以检出正在生长的病原体，也能检出潜伏的病原体，既能确定既往感染，也能确定现行感染。对那些不容易外培养和不能在实验室安全培养（如立克次氏体）的病原体，也可用基因诊断进行检测。 在传染性流行病中，采用基因诊断分析同血清型中不同地域、不同年份病原体分离株的同源性和变异性，有助于研究病原体遗传变异趋势，指导暴发流行的预测。 基因诊断在判断个体对某种重大疾病的易感性方面也起着重要作用。 基因诊断在器官移植组织配型中的应用也日益受到重视。 基因诊断在法医学中应用主要针对人类DNA遗传差异进行个体识别和亲子鉴定。 二、基因治疗 （一）基因治疗的概念 基因治疗是用正常的基因整合入细胞，以校正和置换致病基因的一种治疗方法。目前从广义上来讲，将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其体内发挥作用，以达到治疗疾病目的方法，也谓之基因治疗。 目前基因治疗所采用的方法基本上可分为以下几种： 1基因矫正 基因矫正指将致病基因的异常碱基进行纠正，而正常部分予以保留。 2．基因置换 基因置换就是用正常基因通过体内基因同源重组，原位替换病变细胞内的致病基因，使细胞内的DNA完全恢复正常状态。 3．基因增补 基因增补指将目的基因导入病变细胞或其他细胞，不去除异常基因，而是通过目的基因的非定点整合，使其表达产物补偿缺陷基因的功能或使原有的功能得到加强。目前基因治疗多采用此种方式。 4．基因失活 早期一般是指反义核酸技术。它是将特定的反义核酸，包括反义RNA，反义DNA和核酶导入细胞，在翻译和转录水平阻断某些基因的异常表达。近年来又有反基因策略、肽核酸、基因去除和RNA干扰技术。 （二）基因治疗的基本程序 1治疗性基因的选择 选择对疾病有治疗作用的特定目的基因是基因治疗的首要问题。对于单基因缺陷的遗传病而言，其野生型基因即可被用于基因治疗，如选用腺苷脱氨酶(ADA)基因治疗ADA缺陷导致的重症联合免疫缺陷综合症。 2基因载体的选择 有病毒载体有非病毒体两类，多用病毒载体，如逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒载体。 小结：常用病毒载体的比较
3靶细胞的选择 根据受体细胞种类的不同，基因治疗分为体细胞的基因治疗和生殖细胞的基因治疗两大类。 4基因转移 将基因导入哺乳动细胞的方法有两种：一是非病毒介导的基因转移；二是病毒介导的基因转移。非病毒介导的基因转移方法包括物理的和化学的方法等。物理方法有显微注射、电穿孔、DNA直接注射和基因枪技术等。化学方法有磷酸钙沉淀法、DEAE-葡聚糖法、脂质体介导的基因转移等。 导入基因的方式有两种：一种是间接体内疗法，即在体外将外源基因导入靶细胞内，再将这种基因修饰过的细胞回输病人体内，使带有外源基因的细胞在体内表达相应产物，以达到治疗的目的。其基本过程类似于自体组织细胞移植。另一种直接体内疗法，即将外源基因直接导人体内有关的组织器官，使其进入相应的细胞并进行表达。 5外源基因表达筛检 利用载体中的标记基因对转染细胞进行筛选，只有稳定表达外源基因的细胞在病人体内才能发挥治疗效应。 6回输体内 将治疗性基因修饰的细胞以不同的方式回输体内以发挥治疗效果。 |
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